Patch-clamp : principe, techniques et place dans la recherche

Le patch-clamp est une technique d’électrophysiologie qui mesure avec une très grande précision l’activité électrique d’une cellule ou de certains canaux ioniques de sa membrane. [2] [3] Les canaux ioniques sont des protéines membranaires qui peuvent s’ouvrir ou se fermer et laisser passer des ions, ce qui produit des courants électriques mesurables. [3] Le patch-clamp décrit avant tout une méthode expérimentale de laboratoire et non un examen clinique effectué directement sur une personne comme une prise de sang ou une imagerie. [1] [2] Dans les travaux portant sur le cerveau humain, les enregistrements peuvent notamment être réalisés sur des coupes préparées à partir de tissu déjà retiré au cours de certaines opérations pour une tumeur cérébrale ou une épilepsie. [1]

Comment fonctionne un enregistrement par patch-clamp ?

Une micropipette en verre est placée contre une très petite zone de la membrane de la cellule étudiée. [3] Une légère aspiration permet d’obtenir entre le verre et la membrane une jonction électrique de très forte résistance appelée gigaseal. [3] Cette jonction limite les fuites de courant et réduit fortement le bruit électrique, ce qui rend détectables les courants minuscules traversant la membrane. [3] Selon la configuration choisie, l’appareil peut enregistrer l’activité d’un ou de quelques canaux présents dans un fragment de membrane, ou les courants produits par l’ensemble de la membrane cellulaire. [3] En mode voltage-clamp, l’expérimentateur contrôle la tension électrique appliquée et mesure les courants ioniques correspondants. [2] En mode current-clamp, il est possible d’étudier le potentiel de membrane et, dans les cellules excitables, d’observer des potentiels d’action spontanés ou provoqués par une injection de courant. [2]

Quelles sont les principales configurations ?

La configuration cell-attached, ou cellule attachée, conserve la cellule intacte et enregistre les canaux situés dans la petite zone de membrane enfermée sous la pipette. [3] Cette configuration est stable, mais elle ne permet pas de modifier librement les solutions de part et d’autre du fragment de membrane ni de connaître directement le potentiel de repos exact de la cellule. [2] [3] Dans la configuration whole-cell, ou cellule entière, le fragment de membrane sous la pipette est rompu afin de mettre en continuité l’intérieur de la cellule et la solution contenue dans la pipette. [3] Le mode cellule entière donne accès aux courants macroscopiques produits par les canaux répartis sur toute la membrane. [3] Il modifie toutefois progressivement le milieu intracellulaire, car la solution de la pipette peut remplacer une partie du contenu naturel de la cellule. [3] Les configurations inside-out et outside-out isolent un fragment de membrane en exposant respectivement sa face interne ou sa face externe à la solution du bain. [3] Elles servent à étudier séparément l’effet de substances agissant du côté intracellulaire ou extracellulaire d’un canal ionique. [3]

Que mesure le patch-clamp ?

Un enregistrement sur canal unique permet notamment de mesurer l’amplitude du courant et le temps pendant lequel le canal reste ouvert ou fermé. [3] Ces données servent à calculer la probabilité d’ouverture du canal et à analyser la dynamique de ses transitions entre différents états. [3] La variation du courant selon la tension ou la composition ionique aide également à caractériser la conductance, la sélectivité et le fonctionnement du canal étudié. [3] Sur des neurones, le patch-clamp peut caractériser des propriétés telles que le potentiel de repos, la forme des potentiels d’action, l’excitabilité et les réponses synaptiques. [1] [2] L’enregistrement simultané de plusieurs neurones, appelé multipatch, permet en plus de rechercher des connexions synaptiques entre les cellules enregistrées. [1]

Comment le patch-clamp est-il utilisé sur des tissus humains ?

Dans les études du cortex humain décrites, le tissu retiré pendant l’opération est rapidement transporté au laboratoire dans un liquide cérébrospinal artificiel froid et oxygéné, puis découpé en fines tranches. [1] Ces coupes préservent pendant un temps limité des neurones vivants et des connexions synaptiques fonctionnelles, ce qui permet leur étude électrophysiologique. [1] [2] Cette approche sert à comparer les propriétés de neurones humains avec les connaissances issues des modèles animaux et à étudier l’organisation des microcircuits cérébraux. [1] Le prélèvement n’est donc pas réalisé spécialement par la technique de patch-clamp : dans ce contexte, l’enregistrement intervient ensuite au laboratoire sur du tissu qui a déjà été retiré pour les besoins de l’intervention. [1]

Quelles sont les limites de cette technique ?

La qualité des résultats dépend notamment de l’état des cellules ou des coupes, des propriétés de la membrane, de la qualité de la jonction avec la pipette et de l’habileté technique de l’opérateur. [1] [2] Dans les coupes cérébrales, la fragilité de la membrane, la taille des cellules et les courants synaptiques environnants peuvent compliquer l’obtention et l’interprétation des enregistrements. [2] Lors d’un multipatch, la multiplication des pipettes augmente le stress mécanique exercé sur la coupe et peut réduire la stabilité des enregistrements. [1] Les tissus cérébraux humains disponibles proviennent de personnes ayant nécessité une opération, de sorte que la maladie sous-jacente, les médicaments, l’âge, le sexe ou la procédure chirurgicale peuvent influencer les observations. [1] L’absence de tissu cérébral humain parfaitement sain comme témoin limite également la généralisation des résultats à l’ensemble de la population. [1] Les résultats d’une expérience de patch-clamp doivent donc être interprétés en fonction du type de cellule, de la configuration utilisée, des solutions expérimentales et de l’origine du tissu. [1] [2] [3]