Test clonogénique : principe, déroulement et interprétation

Un test clonogénique est une technique de laboratoire qui évalue la capacité de cellules souches ou progénitrices à se multiplier et à se différencier pour former des colonies dans un milieu de culture adapté. [2] Dans le domaine de l’hématopoïèse, c’est-à-dire de la production des cellules sanguines, il fournit une information fonctionnelle qui complète l’identification des populations cellulaires par cytométrie en flux. [2] Le terme recouvre plusieurs tests selon la lignée cellulaire recherchée et ne doit pas être confondu avec le seul test CFU-GM consacré aux progéniteurs des granulocytes et des macrophages. [2]

Que mesure un test clonogénique hématopoïétique ?

Les cellules souches hématopoïétiques peuvent produire différentes lignées de cellules sanguines en passant par des progéniteurs dont les possibilités de différenciation deviennent progressivement plus restreintes. [2] Le test recherche ces progéniteurs de manière indirecte en observant les colonies qu’ils forment après leur mise en culture. [1] [2] Le nombre, la morphologie et la composition des colonies renseignent sur la capacité des cellules de l’échantillon à proliférer et à se différencier dans les conditions choisies. [2] Les échantillons étudiés peuvent notamment provenir de la moelle osseuse, du sang périphérique ou du sang placentaire. [2]

Quels sont les principaux types de colonies recherchés ?

Les colonies sont classées selon les lignées de cellules sanguines auxquelles leurs progéniteurs peuvent donner naissance. [2] Les CFU-GM correspondent aux progéniteurs de la lignée granulocyte-macrophage, tandis que les CFU-G et CFU-M sont respectivement associées aux lignées granulocytaire et macrophagique. [2] Les CFU-E et les BFU-E représentent deux catégories de progéniteurs de la lignée érythroïde, qui conduit aux globules rouges. [2] Les CFU-GEMM sont capables de former des colonies comprenant plusieurs lignées, notamment granulocytaires, érythroïdes, monocytaires et mégacaryocytaires. [2] Le milieu de culture et les facteurs de croissance employés sont choisis en fonction des progéniteurs que le laboratoire souhaite mettre en évidence. [1] [2]

Comment le test est-il réalisé au laboratoire ?

Les cellules de l’échantillon sont déposées à une concentration déterminée dans un milieu semi-solide, souvent à base de méthylcellulose, contenant des facteurs qui favorisent leur croissance et leur différenciation. [1] [2] Le caractère semi-solide du milieu permet la formation de colonies distinctes, ensuite identifiées et comptées selon leur aspect. [2] Pour le test CFU-GM des greffons hématopoïétiques, les recommandations françaises de juillet 2014 décrivent une lecture généralement effectuée après quatorze jours d’incubation, sauf justification contraire. [1] Cette lecture est réalisée au microscope inversé sur l’ensemble de la boîte de culture, y compris ses bords. [1]

À quoi sert le test CFU-GM pour un greffon ?

Dans le contexte précisément couvert par la Pharmacopée française de 2014, le test CFU-GM participe au contrôle de la qualité des greffons de cellules souches hématopoïétiques. [1] Il évalue la présence de progéniteurs fonctionnels capables de produire des colonies granulocytaires et macrophagiques dans les conditions de culture. [1] Cette mesure est différente d’une simple numération des cellules portant le marqueur CD34, car elle repose sur leur comportement fonctionnel en culture. [1] [2] La quantité de colonies formées dans un greffon a été associée à l’efficacité de la prise de greffe des neutrophiles et des plaquettes après transplantation. [2]

Comment les résultats sont-ils interprétés ?

Pour le contrôle des greffons, les résultats peuvent être exprimés par rapport au nombre de cellules mises en culture, au volume de la poche ou au poids du receveur. [1] La clonogénicité correspond au rapport entre le nombre de colonies CFU-GM observées et le nombre de cellules CD34 mises en culture. [1] Le document français de 2014 précise que la dose minimale attendue doit être définie à partir de la relation entre cellules CD34 et CFU-GM observée dans le laboratoire, en tenant compte de l’origine des cellules souches. [1] Dans ce même cadre documentaire, une culture comportant peu de CFU-GM ou une clonogénicité anormalement faible ou forte doit conduire le laboratoire à signaler un problème possible de qualité du greffon et à en rechercher les causes lorsque cela est possible. [1]

Quelles sont les limites du test ?

Le résultat dépend des conditions de culture, du type d’échantillon, de sa conservation, de la concentration cellulaire choisie et de la lecture des colonies. [1] Une boîte très riche en colonies ne traduit pas nécessairement une meilleure clonogénicité, car une concentration excessive peut entraîner une saturation de la culture. [1] La technique doit donc faire l’objet d’une validation portant notamment sur sa répétabilité, les différences entre lecteurs et la vérification des lots de milieu. [1] Le test en culture évalue surtout des progéniteurs à court terme, dont beaucoup ont une capacité d’auto-renouvellement et de reconstitution à long terme limitée. [2] Son résultat doit ainsi être interprété avec les autres caractéristiques cellulaires et les contrôles techniques plutôt que comme une mesure isolée de toutes les propriétés du greffon. [1] [2]