Techniques de diagnostic moléculaire en infectiologie : principes, méthodes et limites

Les techniques de diagnostic moléculaire regroupent ici des méthodes de laboratoire qui recherchent les acides nucléiques, c’est-à-dire l’ADN ou l’ARN, d’un agent infectieux dans un prélèvement. [1] Elles peuvent servir à identifier un ou plusieurs agents pathogènes, à quantifier certaines cibles génétiques, à rechercher des mutations ou des gènes de résistance et, avec certaines méthodes de séquençage, à explorer des agents rares ou inconnus. [1] Il ne s’agit pas d’une maladie et ces techniques n’ont donc pas de signes propres : elles constituent une famille d’examens dont le choix dépend de ce que le laboratoire cherche à détecter. [1]

Que recherchent les examens moléculaires ?

Les méthodes moléculaires se distinguent de la culture, qui cherche à faire croître un microorganisme, et des méthodes immunologiques, qui détectent notamment des antigènes ou des anticorps. [1] Leur cible est généralement une séquence génétique sélectionnée parce qu’elle correspond à un microorganisme, à un groupe de microorganismes ou à une caractéristique particulière comme une mutation de résistance. [1] Certaines méthodes sont conçues pour rechercher un agent connu, tandis que le séquençage peut analyser un ensemble beaucoup plus large de séquences présentes dans un échantillon. [1]

PCR, PCR quantitative et PCR digitale

La PCR amplifie une séquence d’acide nucléique ciblée afin de la rendre détectable et constitue une méthode très utilisée pour identifier des agents infectieux connus. [1] La PCR quantitative, ou qPCR, suit l’amplification en temps réel grâce à un signal fluorescent et peut fournir une analyse qualitative ou quantitative de la cible recherchée. [1] Une PCR multiplex utilise plusieurs jeux d’amorces et de sondes pour rechercher simultanément plusieurs agents dans un même échantillon. [1] La PCR digitale, ou dPCR, répartit la réaction dans de nombreux compartiments afin de réaliser une quantification absolue de la cible sans recourir à une courbe étalon. [1] Cette répartition peut faciliter la détection de faibles quantités de microorganismes, de mutations minoritaires ou de variants rares. [1]

Amplification isotherme et analyse des courbes de fusion

L’amplification isotherme multiplie une cible génétique à température constante et ne nécessite donc pas les cycles de température utilisés par la PCR classique. [1] Des techniques comme LAMP, RPA ou NASBA ont été développées pour permettre une détection rapide, notamment avec des dispositifs utilisant une fluorescence, un changement de couleur ou une bandelette. [1] NASBA amplifie préférentiellement l’ARN, alors que les autres méthodes ont des mécanismes et des contraintes de conception différents. [1] L’analyse de fusion à haute résolution, appelée HRM, distingue des molécules d’ADN d’après leurs courbes de fusion et peut contribuer à identifier une espèce, un génotype ou une mutation de résistance. [1]

Puces génétiques et séquençage

Les puces génétiques reposent sur l’hybridation entre les séquences de l’échantillon et des sondes fixées sur un support ou associées à des microsphères. [1] Elles peuvent rechercher simultanément de nombreux agents ou gènes de résistance, mais seulement si les séquences correspondantes ont été prévues dans la conception de la puce. [1] Une puce ciblée ne permet donc pas, à elle seule, de détecter un agent nouveau dont la séquence n’est pas incluse. [1] Le séquençage à haut débit peut lire un très grand nombre de séquences et rechercher simultanément plusieurs microorganismes sans dépendre d’une culture. [1] Il peut compléter les examens habituels lorsque ceux-ci n’apportent pas de cause claire et peut contribuer à l’identification d’agents rares ou inconnus. [1] Le séquençage de troisième génération produit des lectures plus longues et certaines plateformes peuvent analyser directement l’ARN, mais leur taux d’erreur constitue encore une limite importante en microbiologie. [1]

Pourquoi un résultat peut-il être imparfait ?

Aucune technique moléculaire n’élimine totalement le risque de résultat faussement positif ou faussement négatif. [1] Une contamination par des acides nucléiques peut notamment produire un signal positif qui ne correspond pas à la cible réellement présente dans l’échantillon. [1] À l’inverse, une quantité trop faible de cible, des inhibiteurs dans le prélèvement, une enzyme inactive ou des paramètres de réaction inadaptés peuvent empêcher la détection. [1] La qualité et la quantité de l’échantillon, la conception des amorces et des sondes ainsi que le réglage des seuils peuvent également modifier les performances. [1] Pour le séquençage, l’analyse informatique et l’interprétation de données complexes représentent une étape déterminante pour attribuer les séquences détectées à un agent pathogène. [1]

Comment choisir entre les différentes techniques ?

Les méthodes ne sont pas interchangeables : certaines privilégient une recherche rapide et ciblée, d’autres la quantification, la recherche simultanée de nombreux agents ou l’exploration de séquences inconnues. [1] La qPCR est notamment adaptée à l’analyse qualitative ou quantitative de cibles courantes, tandis que la dPCR est particulièrement utile pour de faibles quantités de cible ou des variants rares. [1] Les puces et les PCR multiplex peuvent rechercher plusieurs agents connus à la fois, alors que le séquençage offre une exploration plus large au prix d’une analyse plus complexe. [1] Le choix repose ainsi sur la cible recherchée, le besoin de quantification, le nombre d’agents à examiner, les caractéristiques de l’échantillon et les moyens techniques disponibles. [1]